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如何有效预防细胞培养过程的支原体污染

摘要:引起培养细胞污染的微生物有细菌、霉菌、黑胶虫、支原体等,其中支原体是常见的污染物。本文列举了一种我国药典认可的常见检测手段,也提出了行之有效的预防和解决办法。

关键字:细胞培养;实验室;支原体;预防;解决

细胞培养是一种体外增殖细胞的常规实验技术,目前被广泛用于教学、实验室和临床实验。污染控制是细胞培养能否成功的关键所在。引起培养细胞污染的微生物有细菌、霉菌、黑胶虫、支原体等,其中支原体是常见的污染物。

支原体属于缺乏细胞壁的原核微生物,直径约0. 13 ~0. 18 μm,大小介于细菌和病毒之间,可透过一般滤膜(0. 22 μm),因此在细胞培养过程中,细胞极易受到支原体污染。已有许多调查及研究显示,世界范围内正在使用的细胞体系中支原体污染发生率达到 30% ~60% 。中国医学科学院基础医学研究所检测过的国内来源的细胞株系,支原体污染率高达 60% 。

 

支原体感染发生后培养液清澈不浑浊,但 pH 值变化明显,培养液更换后几小时内变为酸性(颜色变黄)。污染初期,显微镜高倍镜下观察发现细胞外形无明显变化但有细小黑色颗粒,所以不容易被发现。虽然支原体可以与细胞长期共存,且随着细胞换液而缓解,但细胞遭受支原体污染后会抑制细胞生长,改变细胞的 DNA /RNA 及蛋白表达,使细胞的转染效率大大降低,并在污染后期引起细胞变形,对后续教学、科研产生严重影响。因此在细胞培养过程中进行支原体检测十分必要。

一、检测手段

荧光染色法:将待测细胞分别培养于Φ3 cm培养皿中,细胞长到 70% ~ 80% 时进行荧光检测。首先,各组细胞用 PBS 清洗 2 次,每次1 min,4%多聚甲醛(PBS 配制)室温固定 20 min,再以含5 μg /ml Hoechst 33342 染料的 PBS 溶液进行染色,5 min 后吸去染液,PBS 洗涤一次,加入少量 PBS 使细胞保持湿润,在荧光显微镜下观察细胞。

二、检测结果

Hoechst 33342 是一种可透过细胞膜并对 DNA染色的细胞核染色试剂。荧光染色法检测支原体污染,就是利用 Hoechst 33342 可与双链 DNA 结合,在紫外光的激发下,释放强烈的蓝色荧光这一特点对细胞加以染色。经过染色,在荧光显微镜下,可见待测细胞1 的细胞周围或细胞膜上有大小不等、不规则荧光着色颗粒,推测为支原体污染细胞(图 1),而待测细胞2 只有细胞核显色,推测为未污染细胞(图 2)

 

 

三、控制办法

1.保持操作环境清洁: 无菌室的滤膜要定期清洗和更换;每次进行细胞培养操作前,无菌室和超净台都要用诺福消毒剂消毒(诺福高工http://blog.sina.com.cn/u/3291672703)灭菌;每次实验完毕要用消毒剂浸泡的抹布擦拭操作台,避免交叉污染;定期对二氧化碳培养箱进行消毒灭菌。

2.实验用品无菌处理: 所有用品都要经过高温消毒灭菌;培养基、血清、胰酶等试剂均要经过检测确定无支原体污染后方可使用。

3.操作者遵守无菌室消毒规定: 由于正常人口腔带有支原体,因此进入无菌室一定要带好口罩、帽子(口罩必须罩住口鼻,帽子必须将头发全遮在里面),鞋套,穿隔离衣,带乳胶手套,并用 75% 酒精擦拭手套表面。

4. 操作过程严格按照无菌操作要求: 开始要先用 75%用精棉球擦拭瓶口,在火焰上烧灼瓶口,必须在火焰周围无菌区内打开瓶口,瓶口要再次转动烧灼 ;操作时尽量不要讲话;要常更换吸管,一旦发现吸管触及手和其他物品应弃去。所有操作过程要在距离超净台边缘 10 cm 以内的无菌区域进行。

5. 定期进行支原体污染检测 : 对实验室中的培养物定期进行支原体检测,预防为主,不能等到发现有支原体污染时再进行检测,发现已经污染支原体的培养物,灭活后弃之,严禁随意倾倒、随意丢弃。及时更换新的培养物,避免支原体污染。

四、常规方法

很多生物安全实验室一直使用3383金沙娱干雾过氧化氢灭菌设备,能迅速有效的杀灭支原体,减少日常维护和清洁的时间。作为一种新型的实验室消毒产品,3383金沙娱干雾灭菌设备,具备实验室空间消毒灭菌的众多优势:

1.高效消毒灭菌:能够迅速杀灭病原菌(支原体、衣原体、立克次氏体)、芽孢在内的200多种微生物,灭菌原理特殊无耐受性产生;

2.设备体积小,操作方便,灵活移动满足不同空间需求,便于携带和移动;

3.品质保证,拥有众多检测批文和检测报告

4.无色无毒,无残留,安全可靠,完全分解为氧气和水;

5.验证资料齐全,提供验证模板,容易通过高标准灭菌验证;

6.杀菌时间超短,2-3个小时可完成整个灭菌流程,高效节能;

7.干雾气体性能稳定,不受环境湿度、温度、活性稳定攻击微生物活体;

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