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气溶胶核酸污染导致“假阳性”频发,值得检验人警惕

6月2日,国家卫健委发布《关于进一步加强新冠病毒核酸检测全链条监管的通知》。

要求严格检测机构和人员资质管理,规范样本采集、保存和转运管理,强化核酸检测机构日常监督管理,加强应急状态下核酸检测机构监管,提升核酸检测资源利用效能,严格落实核酸检测机构退出机制。

面对频频爆出的“第三方检验机构屡次暴雷”、“多家实验室频频爆出假阳性”、“为了赚钱故意制造假阳性”等新闻,在国家卫健委的高度严格要求下,我们检验科核酸检测实验室能做些什么,该做些什么?

5月23日,国家卫生健康委医政医管局监察专员郭燕介绍:“尽管核酸检测的特异性为100%,但在实际工作中,实验室可能因实验过程的操作造成污染而导致假阳性。”

检测的准确性是所有检验实验室的生命线。而造成假阳性最主要的原因是核酸气溶胶污染问题。下面就PCR实验室出现假阳性(核酸污染)的具体原因及应对措施分析如下:

一、核酸气溶胶污染的直接因素

1PCR扩增产物的污染

较常见,尤其是第一代PCR技术,发生概率在60%以上。

PCR产物经反复多次的扩增,其复制量远远超过PCR的检测极限,一个气溶胶所包含的拷贝数可以在104~106copies,这个拷贝数对应的PCR检测Ct值在24左右!因此即使是极微量的污染也足以造成实验结果假阳性。

但是,在第二代PCR技术中,采用了防污染UNG/UDG技术,该技术可以显著降低扩增产物引起的污染,则该因素发生污染的概率能降低到10%以内。而国内几乎所有获批准的新冠检测试剂盒,均采用了UNG防扩增产物污染技术;因次,扩增产物引起的污染概率,并没有大家想象中那么高。

但仍需要重点关注PCR扩增管的密封性问题!

如果密封不严,扩增完成后有蒸发现象,液面不整齐,或者扩增过程中有炸管声音,则应该更换PCR扩增管/封板膜的批次或者供应商。

2阳性质控品引起的污染

较常见,发生概率在40%~60%之间。

以重组质粒作为阳性质控品,发生污染的概率更大;以构建的假病毒或重组病毒作为阳性质控品,参与核酸提取的过程中,也容易发生气溶胶污染;在试剂的配制过程中,接触了污染的容器、移液器、枪头、溶液等物导致试剂被污染。

润联吕工认为,这是目前实验室引起的核酸污染最主要原因!

3待测样品被污染

发生概率在10%~30%之间。

放置样品的容器被污染,或由于容器密封不严导致样品与外界接触被污染;待提取样本中含有强阳性样本,其提取的样品中含有高浓度的阳性核酸,形成气溶胶,造成污染。

气溶胶是由空气与液体表面摩擦而产生的,开盖、晃动反应管及污染加样器的反复吸样都可形成气溶胶,从而导致交叉污染。

以上核酸来源,均形成气溶胶扩散至空气中,或吸附到物体表面。

因此,应尤其重视由气溶胶导致的污染问题。重度污染假阳性的ct值可在24左右,中度污染ct值在30左右;轻度污染ct值在33左右。

从核酸污染的分布来看,主要在2个地方:

空气中的核酸气溶胶:弥散到实验室各个角落,比较棘手;吸附到仪器设备表面上的核酸污染物:移液器、离心机、核酸提取仪、传递窗、拆开的试剂盒、枪头盒、打开的耗材等表面。

PCR实验室只要出现了污染,之前的结果报告就变为了无效,而且也无法进行其他的实验操作。必须找出并彻底清除污染源,才能得到准确有效的实验结果。

 

二、核酸气溶胶污染的间接原因

1不合理的实验室建设

严格的PCR实验室应有标准的正负压系统及四分区,实验室应按照生物安全二级实验室及PCR实验室设计基本要求来建设。

可参考的标准为《GB50346-2011建设标准生物安全实验室建筑技术规范》及卫健委下发的《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》。

另外说些现行技术指导原则里面没有提到,但也最容易忽视的风险点!

2生物安全柜

现有技术指导原则只要求了选择BSL-Ⅱ级生物安全柜,但并未规定具体型号。从2区负压的角度考虑,建议配置的是A2型。但是从临床观察来看,非B2型生物安全柜污染的概率远远大于B2型,因此建议使用B2型号生物安全柜加核酸模板。

A1型、A2型、B1型为70%气体通过HEPA过滤器再循环至工作区;B2型为100%全排放型,无内部循环气流。因此只有B2型可以用于加样(阳性对照)。因为HEPA过滤器并不能有效过滤气溶胶质粒。

若生物安全柜配置错误,在加样的时候,循环风很容易造成核酸气溶胶的形成,从而造成污染,且污染很难清除。

不同型号的生物安全柜区别

3传统的去污方式并不能有效降解核酸

紫外灯能杀灭病毒,但是《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》指出,短片段的基因核酸对紫外线损伤不敏感。

常规消毒剂如酒精、碘化物、戊二醛类、季铵盐等虽然能杀菌,但是不能降解核酸,或降解效率较差。尤其是酒精,它其实是核酸提取试剂中的一个组分。

已知的消毒剂中,次氯酸盐类消毒剂可以一定程度的降解核酸,但是腐蚀性强,不能处理精密仪器及金属制品。

酶解法:费用高,降解的核酸中仍有大片段存在,具有完整的遗传信息,可通过PCR扩增出完整的片段,酶促处理与核酸扩增反应不相容。

4那些容易忽视的操作细节

处理样本时,手套贴合性不够;处理样本时,忘记更换tip枪头,造成样本交叉污染;处理阳性样本时,造成其他样本污染,从而造成假阳性。

吸取阳性对照(质粒)没有遵循“慢吸快打”的原则(这个需要练习,形成肌肉记忆),往往是“快吸快打”,造成阳性样品污染枪头;或者在生物安全柜循环风的影响下,造成气溶胶飞溅,污染加样区域,最好使用带有滤芯的枪头。

加样区没有放置桌面垃圾桶:加完样品的tip枪头可能含有高浓度的阳性核酸靶标,如果乱丢弃,可能造成气溶胶污染。应把tip枪头丢入含有次氯酸溶液的桌面垃圾桶中。因为次氯酸容易挥发,因此应每天更换含氯消毒液!

5污染高风险区域

在润联吕工的临床实践中,发现以下区域存在阳性污染的概率更大:

润联吕工在某实验室发生污染时,在不同区域分别采集10个样本,通过PCR扩增分析后,比较不同区域的阳性检出率。发现样品处理区的核酸提取仪与离心机污染的程度最高(8/10)。在临床实践中,移液器也是污染的高风险项。

不同实验室的污染情况都是不一样的,就像这个世界上,幸福的家庭都一样,不幸的家庭倒是各有各的不幸。同理,规范的实验室都一样,污染的实验室各有各的污染情况。以上数据仅供参考。

 

三、PCR污染的监测

在日常实验室运行中,要时刻注意监测实验室的污染情况,了解实验室有无污染、污染原因、污染程度,以便采取有效措施,防止和消除污染。

一般通过设置阴性质控品来监测污染情况。

1试验过程监测

目前,多数试剂盒的阴性对照是在配置PCR反应液,上机扩增这一环节进行质控,没有对核酸提取进行质控。

因此,每次开展试验应增加3个纯化水样品,分布于待检样品的前、中、后位次或棋盘法随机放置,参与核酸提取、扩增,保证实验样品处理、核酸提取、扩增3个步骤的全过程的阴性监控。防止整个试验过程中可能存在的阳性污染。

2日常实验室环境监测

  • 监测对象

实验室内的仪器设备、空气、物体表面;

  • 环境监测

每个实验区放置10ml纯化水或生理盐水(敞口),1个小时后取样200μl,作为样品,参与提取、扩增,分析实验室环境是否存在气溶胶污染。

  • 物体表面监测

物体表面擦拭取样:用棉拭子蘸取生理盐水,在实验室台面(尤其是四周死角)、仪器表面和内孔涂抹取样后,放入约0.5ml生理盐水中取样,作为样品,参与提取、扩增,分析物体表面是否存在气溶胶污染。

 

四、解决PCR实验室污染的方法

解决PCR实验室污染的方法:润联 2022 PCR CLEANER 策略。

1人、机、料、法、环

首先针对上述产生气溶胶污染的原因进行分析,从人员、硬件配置、物料、方法(SOP)、环境五个方面进行认真复盘,整改。

这是保证实验室长治久安、不发生污染的基本前提。

2发生污染时的处理

实验室一旦发生污染,检测工作应立即停止,直到确认消除污染后才能重新开始检测。首先,要查找污染源和明确污染范围。然后,根据污染源和污染范围采取有效的去污染措施,结合各种不同方法以达到最佳效果。

发生污染时,处理措施根据污染的区域来源:

  • 吸附于仪器物体表面的核酸气溶胶污染
  • 小空间安全柜内的核酸气溶胶污染
  • 大空间中的核酸气溶胶污染

紫外线照射无法降解200bp以下的短片段核酸,作用距离以及效果非常有限,并且容易产生处理死角。

那么有没有能够在短时间内在不影响实验室工作的同时,又能完成对实验室内的核酸进行清除降解的设备?

可以通过润联提出的“2022 PCR CLEANER 解决方案”对空气及物表中的气溶胶进行清除!

清除效率高,最快可1小时解决空气中的气溶胶污染问题!“解决方案”更大的价值是,每天实验结束,打开仪器60~90分钟,能大大降低实验室的污染概率。毕竟核酸气溶胶的污染,预防大于治理!“不污染”才是最好的治理!

  • 吸附在仪器、设备、耗材表面上的核酸污染处理

更换污染区的耗材(主要是吸头和离心管);实验服、工作服应用次氯酸盐溶液浸泡1小时后,进行洗涤处理;尽量使用一次性生物安全Ⅱ级防护服。

可以选用没有腐蚀性、对试验人员及环境友好、无刺激的核酸清除剂,如润联提供的“NOVOCIDE核酸污染清除剂”。主要原理是通过氧化作用,清除效果强,已在多个国家级疾控使用,比其他传统的酶解法、常见的强氧化剂(次氯酸盐)降解效果更好!更加安全!不含生物酶,无腐蚀性,无致畸、致癌性。该试剂可以处理易腐蚀的区域,如在移液器、生物安全柜、离心机、传递窗等区域通过设备或直接进行喷洒清除。

通过设备处理后的空间,直接通风即可完成整个去污流程,无需擦拭,极大地缩短了工作时间。

注意:试验耗材、工作衣等进行121℃30分钟高压,虽然有一定的作用,但并不能完全去除质粒核酸的污染。严禁PCR扩增产物进行高压,尤其是在2区进行高压,高压蒸汽非常容易造成扩增产物气溶胶扩散。

更多产品详情请咨询 润联吕工 17302619613(微信同号)